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前沿顯微成像技術(shù)專題——轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡(1) - 分析行業(yè)新聞

日期:2023-02-03 16:07 瀏覽次數(shù):135

傳統(tǒng)的熒光顯微技術(shù)在生物成像領(lǐng)域有兩個難以克服的挑戰(zhàn):一是對生物樣品的結(jié)構(gòu)做3D成像。在傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡中,照明光會照亮光路上的整個樣品,來自非焦平面的雜散光信號也會被成像物鏡收集到(圖1),干擾所要觀察的樣品信號,不但降低橫向分辨率,軸向分辨率也只能達到2.5μm左右,比大多數(shù)生物結(jié)構(gòu)都要大,因此很難對樣品3D結(jié)構(gòu)清晰而準(zhǔn)確地成像;另一個挑戰(zhàn)是對樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰成像。在觀察細胞內(nèi)部活動時,細胞膜的熒光信號會對成像產(chǎn)生極大的干擾。

圖1 小鼠腎臟切片(厚度20μm)分別在 (a) 寬場和 (b) 熒光共聚焦顯微鏡下的成像效果。哺乳動物上皮細胞(厚度50μm)分別在 (c) 寬場和 (d) 熒光共聚焦顯微鏡的成像效果。Scale bar: 20μm。(Adapted from Jonkman and Brown 2015)

如何排除這些來自非焦平面的干擾信號呢?早在1953年,美國學(xué)者馬文·明斯基就提出了“共聚焦”的構(gòu)想。經(jīng)過30年的發(fā)展,這一想法逐漸成為今天非常成熟的 ????????????WYS-10C 共聚焦顯微成像技術(shù)。“共聚焦”的原理就是在樣品的共軛焦平面上添加一個帶有“針孔”的擋板(圖2),通過針孔阻斷雜散光,提高分辨率和對比度。共聚焦顯微鏡具有較好的光學(xué)切片能力,軸向分辨率可提高到500 nm左右。

圖2 共聚焦原理示意:位于共軛平面上的針孔阻擋了來自樣品上方 (a) 和下方 (b) 的雜散光,只有來自焦平面的光才能通過針孔進入探測器(c)。

傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微鏡使用逐點掃描,用光電倍增管(PMT)作為檢測器,雖然成像清晰,但是速度比較慢。而且PMT的光電轉(zhuǎn)換效率也比較低,需要較強的激發(fā)光。這就導(dǎo)致這種技術(shù)的光漂白和光損傷非常大,極不適用于活細胞成像。

為了對活細胞進行快速成像,我們本期專題的主角——轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡閃亮登場了。

轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡

圖3 帶有阿基米德螺旋狀針孔的Nipkow Petran轉(zhuǎn)盤Nipkow Petran轉(zhuǎn)盤。針孔直徑為d,間距為s。

轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡的原理是在物鏡像平面上放置一個 Nipkow 轉(zhuǎn)盤,轉(zhuǎn)盤上分布著排列成阿基米德螺旋的針孔(圖3),激光光源覆蓋所有針孔的范圍(即掃描區(qū)域),每當(dāng)轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)30°,一個針孔就掃描圖像上對應(yīng)的一塊區(qū)域,以此來實現(xiàn)對樣品的完整掃描。與傳統(tǒng)的點掃描方式相比,這種多點同步掃描方式不僅大大提高了采集速度,也意味著可以使用面陣相機(背照式sCMOS或EMCCD)取代PMT,提高量子效率,從而降低激發(fā)光功率,大大降低了對樣品的光漂白和光損傷。轉(zhuǎn)盤共聚焦模塊通常是獨立的,可以加在顯微鏡的相機端口(圖4)。圖像亮度、對比度和光學(xué)切片質(zhì)量都可以通過優(yōu)化轉(zhuǎn)盤性能得到改善。

圖4 Yokogawa CSU-X1轉(zhuǎn)盤共聚焦裝置示意。該裝置包括電動旋轉(zhuǎn)針孔盤和微透鏡盤,可安裝在顯微鏡的攝像機端口上。(From Zeiss Campus)

與激光掃描共聚焦相比,轉(zhuǎn)盤式共聚焦具有高速,高靈敏度,易于安裝等優(yōu)點,更適合研究活細胞及其內(nèi)部動態(tài)過程。

透射率

入射光通過轉(zhuǎn)盤的比率稱為透射率T,可用如下公式計算:



D:針孔直徑;S:針孔間隔距離。
針孔直徑?jīng)Q定了穿過針孔的光的多少——較大的針孔可以讓更多的光通過;而間隔距離決定了較長尺度上的阻斷雜散光的能力。離焦平面足夠遠的雜散光會進入相鄰的針孔,這一過程稱為針孔串?dāng)_(Pinhole cross-talk)。串?dāng)_的程度取決于樣品,樣品越厚影響越大。增加間隔距離可以降低串?dāng)_,但代價是減少光的通過率。

當(dāng)我們帶入典型值D=25μm和S=250μm,可以得到透射率僅為1%,說明絕大多數(shù)光(主要是雜散光)都可以被阻擋。然而,激發(fā)光強和相機靈敏度仍然是決定圖像質(zhì)量的關(guān)鍵。

轉(zhuǎn)盤照明光的透射率可以通過微透鏡進行提高。圖5為 Yokogawa 公司設(shè)計的轉(zhuǎn)盤裝置,它由兩個同軸排列的圓盤組成,每個圓盤包含大約20000個針孔。上圓盤在下圓盤每一個針孔對應(yīng)的位置都裝有微透鏡,將入射光直接聚焦在下圓盤的針孔上,再照射到樣品上。通過添加微透鏡盤,可以將透射率提高一個數(shù)量級(Inoue and Inoue 2002),進一步降低了激發(fā)光強度。

圖5:微透鏡圓盤通過主圓盤的針孔聚焦照明光。發(fā)射光被分色鏡分離進入相機(Graf, Rietdorf and Zimmermann 2005)。

針孔直徑

針孔直徑是轉(zhuǎn)盤式共聚焦系統(tǒng)的一個重要參數(shù)。針孔過大會降低軸向分辨率。針孔過小又會導(dǎo)致照明光過度衍射和過度阻擋發(fā)射光,降低圖像對比度。通常來說,轉(zhuǎn)盤針孔直徑都會由制造商針對60倍或100倍油鏡進行優(yōu)化。

對于給定物鏡的系統(tǒng)來說,有三個關(guān)鍵參數(shù)決定了*佳針孔直徑(Dopt):

  1. 發(fā)射光波長λEm

  2. 物鏡數(shù)值孔徑NAopt

  3. 物鏡放大倍數(shù)Mopt

有如下公式:





以GFP為例(λEm=509nm),使用1.4NA,60x油鏡,*佳針孔直徑為26.2μm。對于1.4NA,100x油鏡,*佳直徑為43.6μm。

分辨率

與常規(guī)熒光顯微鏡一樣,轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的橫向分辨率由光學(xué)系統(tǒng)決定,不過成像對比度增加,因此對樣品細節(jié)的分辨能力更好。在選擇相機時,需要考慮像元尺寸和系統(tǒng)光學(xué)分辨率之間的匹配。(不會選擇?快快點擊閱讀分辨率中——作成像的你不得不了解的真相6

轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的軸向分辨率通常在800nm左右(使用高NA 物鏡)。根據(jù)奈奎斯特采樣定律,z軸步進約為350nm左右。如果需要獲得更清晰,對比度更好的圖像,就需要進行反卷積,我們將在后續(xù)文章中詳細為大家介紹。

針孔聚焦

使用轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡需要一個額外的步驟:由于圖像是在Nipkow-Petran轉(zhuǎn)盤的平面上形成的,因此需要將相機聚焦到該平面上以采集圖像。當(dāng)相機未聚焦時,圖像就會模糊(圖6)。幸運的是,這些針孔為正確的焦平面提供了參考。要將相機聚焦在針孔平面上,首先必須停止轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn),然后將調(diào)節(jié)相機距離直到針孔邊緣清晰,就可以得到清晰的圖像了。

圖6 相機未聚焦導(dǎo)致的圖像模糊。(1.49NA,100x物鏡)(Stehbens, et al. 2012)

采集速度

從原理上來說,轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的*大采集速度取決于至少一個針孔掃描整個圖像的速度——通常是圓盤旋轉(zhuǎn)30°所需的時間。在曝光時間很短的應(yīng)用中(如高速動態(tài)成像),如果曝光時間小于掃描時間,則部分樣品不會被掃描到,就會出現(xiàn)黑線(圖7,左)。轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)速度較慢也會導(dǎo)致不完全掃描,圖像也會出現(xiàn)條紋(圖7,中)。解決這個問題的方法是使相機的曝光與轉(zhuǎn)盤的旋轉(zhuǎn)同步,確保曝光時間等于掃描時間的整數(shù)倍。當(dāng)曝光時間使用比掃描時間長得多時,就可以避免這個問題(圖7,右)

圖7 在較短的曝光時間或較低的轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)速度下,相機曝光和轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)不同步導(dǎo)致樣本覆蓋不均,成像時出現(xiàn)條紋。(1.49NA,100x物鏡)Scale bar: 10μm. (Stehbens, et al. 2012)


然而,在實際的顯微成像設(shè)置中,由于發(fā)射的熒光穿透轉(zhuǎn)盤的透過率很低,為了獲得較好的信噪比,曝光時間一般不會很短,所以系統(tǒng)的*終成像速度其實是受限于相機的曝光時間。對于速度較慢的CCD相機來說,主要是受限于相機自身的讀出幀速。

轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡克服了傳統(tǒng)熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦的缺點,廣泛應(yīng)用于活細胞3D成像,快速動態(tài)成像,長時間時間序列拍攝以及內(nèi)部細節(jié)結(jié)構(gòu)成像等應(yīng)用。然而,由于它是通過抑制光通過來提高分辨率的,搭建系統(tǒng)時,要確保相機能盡可能多地收集光子。因此,在相機選擇上,高靈敏度是首要標(biāo)準(zhǔn)。EMCCD相機曾經(jīng)是轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微系統(tǒng)的**選擇,但現(xiàn)在,越來越多的用戶正轉(zhuǎn)向背照式sCMOS相機(如Prime 95B,Prime BSI),它們具有與EMCCD相機相當(dāng)?shù)撵`敏度,但視野更大,成像速度更快。


在下一期中,我們將繼續(xù)介紹一些不同的轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微系統(tǒng)及其應(yīng)用,請大家繼續(xù)關(guān)注我們的前沿顯微成像技術(shù)專題系列哦~


References

Graf, R, J Rietdorf, and T Zimmermann. 2005. “Live Cell Spinning Disk Microscopy.” Adv Biochem Engin/Biotechnol 95: 57-75.

Inoue, S, and T Inoue. 2002. “Direct-View High-Speed Confocal Scanner: The CSU-10.” Methods Cell Biology 70.

Jonkman, J, and C M Brown. 2015. “Any Way You Slice It - A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.” Journal of Biomolecular Techniques 26: 54-65.

Stehbens, S, H Pemble, L Murrow, and T Wittmann. 2012. “Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.” Nature Methods Enzymology 504: 293-313.