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SEM掃描電鏡生物樣品制備要求和生物樣品制備方法介紹

日期:2023-01-30 09:27:12 瀏覽次數(shù):188

生物樣品具有含水量高、質(zhì)地柔軟、導(dǎo)電性差、容易變形等特點(diǎn),因此采用掃描電鏡觀察生物樣品時(shí),要對(duì)樣品進(jìn)行必要的處理。

SEM掃描電鏡生物樣品制備要求

①樣品要盡可能干燥,若樣品中含有水份,水分揮發(fā)會(huì)造成倉內(nèi)真空度急劇下降,導(dǎo)致圖像漂移,有白色條紋,甚至?xí)绊憻艚z壽命;

②熱穩(wěn)定性好,熱穩(wěn)定性差的樣品往往在電子束的轟擊下分解,釋放氣體和其他物質(zhì),污染掃描電鏡;

③導(dǎo)電性好,導(dǎo)電性差的樣品會(huì)發(fā)生荷電效應(yīng),造成圖像畸變,亮點(diǎn)亮線,像散等;

④不含強(qiáng)磁性,強(qiáng)磁性的樣品觀察一般會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的像散,無法消去,磁性粉末如果粘的不牢固還可能會(huì)吸附到探頭上,損害sem掃描電鏡。

掃描電鏡生物樣品通常指的是動(dòng)物的體液、肌肉、毛發(fā)和一些組織器官,植物的根、莖、葉、果實(shí)等,以及各類微生物(細(xì)菌、真菌等)。生物樣品的含水量高,一般為70%-80%,只有少數(shù)的樣品,如一些花粉、毛發(fā)等可以直接放入sem掃描電鏡中觀察,大部分生物樣品需要經(jīng)過脫水干燥處理后才能進(jìn)行觀察。

掃描電鏡生物樣品制備的關(guān)鍵步驟是干燥,應(yīng)盡量減少因水分蒸發(fā)導(dǎo)致的形變。大多數(shù)動(dòng)植物,特別是柔軟的細(xì)胞和組織,在干燥時(shí)由于體積應(yīng)力和表面張力的作用,容易發(fā)生明顯的塌陷和變形,造成形貌失真。


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SEM掃描電鏡生物樣品制備方法

取材:

一般使用鋒利的刀片將樣品切成5mm見方,高度3mm左右,在滿足觀察條件的前提下,樣品小一些更好,一方面臨界點(diǎn)干燥儀的樣品倉較小,另一方面,小的樣品尺寸固定液更容易滲透到樣品內(nèi)部,固定效果更好。取材完成后,先進(jìn)行清洗(超聲清洗3-5min),再迅速地放置到固定液中,放置樣品脫水皺縮。

固定:

臨界點(diǎn)干燥法前處理常用的固定劑有戊二醛和四氧化鋨。

戊二醛是一種五碳醛,一般配制濃度為1-4%,常用濃度為2.5%(PH7.2-7.4)。一般市場上所售賣的戊二醛濃度為25%,使用前需要對(duì)其稀釋。溫度較高或者堿性條件下,戊二醛容易發(fā)生聚合失去醛基,降低交聯(lián)能力,因此,一般使用0.1M的磷酸緩沖液作為溶劑稀釋戊二醛,并在4℃下保存。

特別注意,戊二醛對(duì)皮膚有硬化作用,皮膚粘上會(huì)變黃,難以洗掉,所以使用時(shí)一定要帶手套。

它的反應(yīng)速度快,是優(yōu)良的前固定劑。用戊二醛前固定的樣品不易變脆,可以進(jìn)行長時(shí)間固定(但Z好不要超過一個(gè)星期),因而適用于遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室或野外現(xiàn)場取材。但戊二醛對(duì)于含脂類較多的樣品固定效果不佳,如細(xì)胞膜。

四氧化鋨是一種很強(qiáng)的氧化劑,一般配制濃度為0.5-2.0%,常用濃度為0.5-1.0%(PH7.2-7.4)。它具有很強(qiáng)的毒性,四氧 化鋨氣體對(duì)呼吸系統(tǒng)有刺激,對(duì)眼睛有嚴(yán)重的破壞作用,因此在使用時(shí)應(yīng)特別小心,盡可能在通風(fēng)櫥中進(jìn)行,并且嚴(yán)格控制用量。但它作為固定劑擁有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):

①四氧化鋨可以與脂類、糖類和蛋白質(zhì)反應(yīng)。其對(duì)脂類的固定作用可以補(bǔ)充醛類固定劑對(duì)脂類固定不足的缺點(diǎn)。

②用四氧化鋨固定材料時(shí),被還原的鋨能沉積在樣品表面上,能增加膜的反差,起到“電子染色”作用,往往細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)比較清晰。

因此,含脂類物質(zhì)比較少的生物樣品(如植物類),采用戊二醛固定,將采取的樣品泡入2.5%的戊二醛溶液中浸泡超過4h即可。對(duì)于含脂類物質(zhì)較多的樣品(如細(xì)胞膜),采用戊二醛和四氧 化鋨雙重固定,先在2.5%的戊二醛溶液中浸泡3h以上,再浸泡在1%的四氧化鋨1h。

漂洗:

用0.1M的磷酸緩沖液沖洗4次,每次20min,洗凈固定液。

脫水:

配置濃度分別為30%,50%,70%,90%,1**%的酒精,用不同濃度的酒精溶液逐級(jí)脫水,從低濃度到高濃度(30%2次,50%2次,70%1次,90%1次,BAI分百兩次)浸泡1-2次,每次10min。

置換:

將脫水后的樣品浸泡在醋酸異戊酯溶液中15min左右,醋酸異戊酯的JI性較低,臨界點(diǎn)干燥時(shí),能夠更好地與二氧化碳置換,干燥效果更好。

干燥:

采用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥。此方法是根據(jù)物質(zhì)處在臨界點(diǎn)時(shí)的特殊物理狀態(tài)設(shè)計(jì)的一種干燥方法。在臨界狀態(tài)下,液體和氣體的密度相等,氣液界面完全消失,液體的表面張力系數(shù)為零。簡單來說就是,通過消除樣品表面張力、使得掃描電鏡樣品在不受表面張力損傷的條件下干燥。

經(jīng)過以上步驟,就能得到飽滿的不皺縮的sem掃描電鏡生物樣品了。